为什么又再读益生菌呢,过去的五天时间,我自己对益生菌的理解,也迭代了好多次。
大家对益生菌不陌生,但对益生菌的了解,很浅。
从去年9月接触这款益生菌,体验,测试,慢慢进入了解,慢慢地知道,与益生菌关系紧密的因素有:菌株、活菌数量、活着能抵达肠道的数量,这是,市场上教大家了解益生菌的几个方面。
很长时间里,我也是这么解读的。
直到,来了两次科拓生物之后,直到,和研发端不断去回溯整个益生菌从最原始的菌株采集,再到筛选、功能评价、临床实验、益生菌生产…来来回回推理几次后,确切地说,直到昨天晚上,我觉得自己思路才最终理了个入门的水平。
那益生菌,真正重点是什么呢?
重点两个:一是,好的菌株;二是,加工技术 。 从这两方面慢慢解析。
菌株好不好,关键是什么?
有人说,菌株的品质,菌株的活性数量。这两个维度理解没问题,关键来了,菌株的品质如何理解?菌株的品质如何判断。
这个问题,我们从一株菌株的确认流程入手解读:先采集(从自然环境里发酵物采集样品回来),再从样品里培养和分离活的菌种(有些菌在采集后就死了),再对菌种进行基因测序进行初步分类,分类出大概是什么类型的菌株(比如是乳酸杆菌、还是双歧杆菌等等,每一组有独立的基因片段、基因序号),再把该菌株保藏起来,做原始菌株种子保藏;这个其实,是一株菌株最原始的诞生。
当然,菌株的采集,也有非常强的时间壁垒,诚如上一篇文章所述,越是原始、越是纯净的环境,才有足够样品可供我们采集菌种。
随着城市化和工业化的进程,很多菌种已经消失不见了。如同有朋友问,干酪张还有可能继续在酸马奶被采集到吗?基本是不可能的,采集到干酪张的酸马奶发酵桶可能都已经不复存在了。
所以,张和平教授20多年前开始建的菌种库意义有多大?保留了多少的原始菌种啊。这也是为何,现在的菌种采集,会往非洲等更穷更偏僻的地方去。
菌株保藏下来后,但距离它是不是一株好菌株,还很遥远,却是,目前市场里,很多人、很多宣传口径的终点。
一株好菌株:
它要有足够强的生命力(够强,才能在与有害菌对抗中能占据上风,能在胃酸等环境理存活下来);
它要有用,明确的功能作用(毕竟,我们吃益生菌,是为了带来对身体的好处)。这两个特点是一定要明确的,才能判断是不是一株好菌株。
明确这两个点,需要做的,就是,筛选和功能研究(足够多的临床实验研究),缺乏这两步,不会有好菌株的诞生。
筛选,就是让菌株通过层层考验,可以说是关关难过关关得过,经过一关又一关考验,才能说它是不是好菌株,类似于,特种兵的选拔,是要经过非常非常多的考核的。
一般会经过哪些关考验呢?
1、人工消化液耐受性筛选。这一关,是为了筛选能活着到达肠道对人体有益的菌,采用人工模拟消化道系统,选择pH2.S胃液3h,pH8.0肠液8h,筛选存活率85%以上,千里挑一。
这一关,估计就会干掉许多菌了;
2、安全性评价筛选。
重点干啥呢?看看会不会有对五脏六腑等各个器官产生负面影响,也即副作用,安全性检测,菌筛选里非常非常重要的环节,如果菌会带来副作用,把它理解成细菌战(有多可怕?);
3、遗传背景筛选 。
主要是考虑会不会存在携带抗生性因子,抗生性因子会不会传导给身体里的有害菌,啥意思呢,如果抗生性因子传导给有害菌,会出现有害菌以后出现杀不死的现象。所以,也是要从遗传角度筛选
摈弃具有潜在安全风险的个体,这种意识非常非常重要;
4、动物模型筛选
动物模型做什么?做功能的验证。
即,我要确定这个菌株对哪些功能有效,在做人临床实验前,先做动物实验。动物实验成功后,再考虑临床试验,临床试验是时间周期非常长且成本非常高的;
5、加工特性筛选
通过动物模型测试后,开启临床实验前,做加工特性测试,加工特性检测这个组是不是具备可以产业化。就是好不好生产出来。
6、临床实验,接下来的临床实验,才是最终能确定,菌株实力的验证。 而这一环节,是绝大多数益生菌企业没有做的或者说还没有实力做的。
临床实验一般会怎么做呢?直接就以科拓生物的临床实验范围来看:
科拓目前做临床试验的有60项,肠道、免疫、心理、口腔、代谢、女性&皮肤、骨骼&关节、心脑&神经、其它等几大板块60项的临床实验。
如何判断是否有做临床实验以及临床实验的最终成果?
在益生菌领域,目前我了解的,有效方法,只有文献这一种方式,也即,他们做了许多临床实验并且成功的那部分,成功发表后,尤其是国际顶级权威期刊。没有这一成果展示,目前来说,没有其它路径可以去判断哪一株菌是有具体的拿种效果(这句话,是益生菌的核心中的核心)。
也就是说,只有做了充分的临床试验项目,并且是实验成功的(实际上,临床实验,失败的要比成功的多的多,了解科研的人了解这一点),才能确定该菌株具有该项的功能。
回到前两句话,目前国内益生菌企业,大部分是没有做临床实验的,因为临床实验周期长、费用高,三四年一个临床实验是很正常的,一个临床实验立项,就要几百万(实际多少,与做的深度有关,只多不少),时间壁垒,无处不在。
另外,你得有充足的资源去做临床试验(医院、人群、多学科相关研究人员),是一个门槛很高的行业。
市场上一些没有做筛选和功能评价、临床实验的益生菌厂,是如何做的呢?
他们得到一株菌株后,判断大概是什么菌,比如,判断出是乳杆菌或是双歧杆菌菌种这个类别,然后自己取一个xxx乳杆菌或是什么什么双歧杆菌,会给它们怎么做宣传呢?
如果没有做筛选,强弱不一定确定;没有做临床试验,具体什么功能是不能确定的,但他们会参考市面上其它公司的该类型菌株做的实验结果,来说自己的菌株也有这种功能。
怎么理解这个差距,菌的分类学里,比如菌属,哪个菌属,相当于是人类的概念,菌属之下再分菌种,比如乳杆菌、双歧杆菌,相当于人类可以再分成男人、女人的概念;菌种之下继续分菌株概念,也就是很具体到个人,刘备、关羽、诸葛亮。
这些是菌株的命名规则,以干酪乳杆菌zhang为例,干酪乳杆菌是种类,zhang则是它的菌株名称。
没有做临床实验,也即相对于没有考核过张飞具体个人,而是粗旷地把张飞是人,诸葛亮也是人,所以张飞应该也有诸葛亮这个人的能力那样宣传。
同样都是植物乳杆菌,或者同样都是乳双歧杆菌,但从基因水平上,不同的菌株的基因长度、质粒的数量都会不一样。有一些差异可能只有百分之零点几,但是这个差异就决定了它的很多生理生化和代谢特性,也就决定了它们会有不同的功能,这也是为何,要通过做足够多的临床实验来验证的原因。
那如何判断菌株是否做过临床试验呢,其实就是问如何查找是否有发表权威的期刊文献。知道菌株的名称之后,可以上网通过名称进行查询,其中围绕它发表的学术论文,都是经过严格验证过的,这些才是评价益生菌功效的核心指标。
所以,以后看到哪个益生菌宣传有什么什么功效,一定要把它含有的菌株一个个去核查是否有相应的学术论文。
这是,理解什么是一株好菌株的思路。
也就是说,一株好菌株,是要层层筛选出来后,并且,经过大量临床实验验证有某些功能后,通过文献权威证明(类似参赛拿奖的道理),才能明确一株菌是不是好菌株。
所以一株好菌株,20多年前就开始采集与保藏,采集好菌种的时间壁垒;漫长的研发时间,技术、时间壁垒。
回到这里,我们来解读干酪张(LC.Zhang)是超级明星菌株。
干酪张(LC.Zhang)
2002年
分离自锡林郭勒大草原自然发酵酸马奶
2008年,历时十一个月完成全基因组测序
也是,中国第一株完成全基因组测序的乳酸菌。标志着我国的益生菌研究进入了基因组时代,追平世界先进水平。
截至2022年12月
围绕该菌株
共授权发明专利29项
发表学术论文190篇
其中SCI收录106篇
上过cell封面
多次上Nature,nature上搜干酪张,会有很多论文
临床实验已经成功验证的项目有:
1 调节肠道菌群 使肠道菌群年轻化
2提高机体免疫力及抗氧化能力
调节血脂代谢、保护肝脏
4 降低肿瘤和结肠癌发生风险
5改善糖耐量受损 预防II型糖尿病
6干预修复雷帕霉素造成的肠道损伤和炎症
7 预防中老年人群上唿吸道感染
8 预防和治疗乳房炎,降低肠道细菌毒素
9减少腹脂及肾脏周围脂肪沉积
10改善肾脏缺血再灌注损伤
11增强上唿吸道免疫应答
12调节肠道菌群稳态,调节肠道微生物共转录
13缓解原肌球蛋白诱导的食物过敏
注意,以上数据,是每年都在增加的,即,对干酪张的研究和分析,并没有停止过,正在发表中及临床实验中的依然在进行。
所以,干酪张为什么被称为top明星呢?为什么会经常登录国际顶级期刊呢?
是因为,对干酪张的研究时间足够长,经得住足够多时间的考验,干酪张是一株生命力非常强的菌株。
更重要的是,对干酪张的研究,足够深入,临床实验足够多,临床实验成果足够让人震撼。
干酪张的发现,打破了国外对益生菌菌种资源的垄断。
这是其一,要有好菌株。
好的加工技术。
说一个现实的问题,作为科技含量较高的产业上游,益生菌菌株研发和菌粉生产等长期把持在外资公司手中,并对我国的益生菌产业形成垄断。
也即,除了菌株,菌粉的加工技术,也是壁垒非常之高的。
我们先看益生菌加工的基本流程工艺:
原料核算—称量溶解—灭菌—接种预发酵—接种发酵—离心浓缩—菌体保护—冷冻干燥—粉碎—混合均匀—充填包装。
接种预发酵、接种发酵这里重点解释下:把菌种按照医药的标准,进行原始种子管理、主种子管理、工作种子管理。
这样做的目的是确保我们的原始种子是做过几千代的传代稳定性的!一根原始种子,可以做成很多支的主种子,一根主种子也可以做出很多的工作种子。这样就会保证菌种的遗传稳定性更加稳定!同时,要对每一批种子、每一级种子做生理生化包括基因方面的检测,从而保证它的稳定性更加强大,同时也保证它的安全性。
这个工艺的流程其实国内国外都是差不多的,但是这里面每一个工艺,里面应用的设备和应用的技术是存在很大差异的!也是为什么这个行业里面的技术门槛会相对来说比较高的原因。
重点解读几个:
发酵培养及控制工程,在实际的产业化过程中,是基于多维的控制来实现最终的产业化:
首先 从基因水平上要了解
通过代谢组学、培养组学等,从基因上了解菌株到底是有什么需求?
比如有很多菌是不利用乳糖的;有很多菌可能对蔗糖利用度也比较低,这些从基因水平上都可以分析得到。
其次 物理特性
比如在实际发酵过程中,发酵体积、搅拌速度、通气量、PH、氧化还原电位……这些都要进行全面的评估。
第三 化学方面
比如氧分压、氧气的浓度、惰性气体的浓度,是什么条件下气调它,菌株长得会更好?
第四 在实际生产过程中要更为重视的
每一种添加物质的把控,就是每一种添加物质,它的基质浓度是多少?添加的这些东西在什么条件下能让菌株代谢表达得更快?
想要它的的代谢物质更旺盛,还是想要它的菌体更加丰富?而这些都是需要综合考虑的包括代谢产物浓度的积累,会影响到它的渗透压渗透压变化了之后,后期加工也会影响菌株的最终的得率和活性。
这也是为何科拓生物发酵设备不允许拍照,在益生菌这个行业里因菌比较特殊的,在产业化过程中所有的加工设备几乎都是根据科拓的菌株和工艺的特性量身打造的,并不是像传统的食品行业,他们可能通用一个大罐,或者通用一些规范。实际上,科拓最初也是买通用的,是生产过程里发现不行,才特别自己定制。
发酵过程中的一些控制,控制了多少点呢?科拓大概控制了600多个检测指标,复杂度不是一点点。
再讲一个,上一篇文章也提到过的包埋技术,在低温冷冻,真空干燥的过程里用的技术。
为什么乳酸菌要进行真空冷冻干燥,而不是像奶粉一样进行喷干等等其他的形式?
是因为乳酸菌跟芽孢类、真菌类的一些微生物相比而言,它的耐受性比较差。要把它做成跟其它微生物差不多的保藏水平,要在常温下保证它的高活性。就要用到以下几个关键技术:
首先,用一个预应激的调控技术。
这个预调控技术,就是指在发酵的过程和发酵的后期,以及在收集菌体到进冻干机之前要给菌株采取一些措施,让菌株基因表达产生一些,比如冷应激蛋白,然后让它提前适应我们将要进去冷冻的环境,就像人进冷库要提前穿个厚棉袄一样。
其次,在真空冷冻干燥过程中,会发生了很多物理、化学变化,以下这些微观的变化,会导致整个菌体的失活和稳定性的丧失:
①低温效应 低温冻结,出现冰晶的形成。
②脱水效应
在干燥的过程中,伴随着一些不光是自由水,还有结合水的丧失。但是有些结合水,是有生物活性的。一些有生物活性的物质脱掉水分子之后,需要让它以共价键的形式跟分子结合,然后把这个基团保护住。
③氧化作用和非氧化作用 通过氧化作用,让它生物活性丢失。其实在这个过程中,还发生了很多非氧化的反应,比如水解、脱氢氨作用、蛋白质自己的变性等等。
如何优化工艺来避免这些问题呢?
利用乳酸菌低温微囊真空冷冻干燥的4个关键技术:
第一个 细胞冷冻冰晶保护技术,防止物理损伤;
第二个 细胞溶质的防护技术,防止溶质的浓缩导致蛋白质变性;
第三个 分子共价键活性保护技术,要把脱去的自由结合水的水分子,或者是脱去一些有生物活性的物质,通过共价键形式加一种物质去进行保护;
第四个 氧化和酶促反应的保护。
这四个技术的应用,是在非常了解冻干曲线变化时的冰晶形成状态、大小,以及不同时期活菌数变化…等非常细微的了解,才能在不同形态、过程里采用相应的技术去解决。
这两个点的解读,大部分人可能难以理解,其实,解读这两个工艺过程里的技术,也不是为了让大家了解这里点技术,而是想说,益生菌的加工技术壁垒说非常之高的。在国内,无论是菌株的采集研究,还是菌粉的生产,除了科拓生物外,整体是非常弱的。
好菌株加上好的技术,才能生产出一些好的产品。
好了,通过好菌株,好的加工技术两个方向,我来再解读一下目前市场上关于益生菌的两个坑。
坑一:菌株添加种类越多越好?
不是菌株越多越好,而是,好的菌株,“有益健康功能”,即选择有明确功效证据的菌株,只有被人体实验证实功效的菌株才是好菌株。
坑二:菌株添加量越多越好?“出厂量”还是“货架期/保质期量”
市场上很多宣传菌株添加量,恨不得冲上九层云霄,越多越好。
是要活的菌株数量,越多越好。但这个活的说法可狡猾的很,市场上很多厂家,是以出厂数量做宣传,实际的货架期,很多早已不足出厂期的50%。
这是因子的关键技术,就是前面加公环节里说的乳酸菌低温微囊真空冷冻干燥的4个关键技术实现的。
为什么要再度解读好菌株和好技术呢?
因为,益生菌这个行业,或者说微生物的世界,都带有一定的神秘色彩,这源于,我们人类,对微生物的了解,还很有限。
这种有限,让市面上五花八门的解读混淆其中,只有让你更深入更细致去了解什么是一株好菌株,以及,加工技术的壁垒等因素,你在选择益生菌的过程中,自然地,会考虑的更多,更重要的是,我们想让你们,也知道,如何去选择,好的益生菌的本事。
蜗牛
2023-6-29